Immunity | CRISPR介导的大片段精准插入技术加速人源化小鼠模型构建

本文针对大于10 kb DNA片段精准插入的技术瓶颈展开研究。传统CRISPR-Cas9方法依赖同源定向修复(HDR)，效率随片段增大显著下降，在异染色质区域和原代细胞中挑战突出。美国哈佛大学Facundo D. Batista和Usha Nair团队在Immunity发表研究，旨在突破合子阶段插入150 kb以上片段的难题。研究首先利用CRISPR-Cas9介导的NHEJ修复途径，通过多sgRNA策略成功实现小鼠VH位点(2.4 Mb)和Vκ位点(3.1 Mb)的大片段删除。随后，通过显微注射将单个0.294 kb的人VH3-33片段精准插入，效率达69%，并证实其功能活性。进一步挑战155 kb大片段插入时，使用BAC载体携带18个人VH基因，注射668枚合子后7只(14%)成功整合，全基因组测序确认单拷贝无脱靶精准整合。最后通过免疫接种验证了人源化小鼠模型的免疫应答功能，并进一步将人源化范围扩展至D/J段。结论：该研究开发了在合子中直接精准插入超过150 kb片段DNA的CRISPR-Cas9方法，可在8周内快速生成功能完整的人源化免疫球蛋白重链小鼠，为无需胚胎干细胞操作和多代繁育的大片段基因敲入模型构建提供通用平台。