Analyse und Vergleich der Feinstrukturen von enzymatisch und fermentativ hergestellten, bakteriellen Homoexopolysacchariden

Von Milch- und Essigsäurebakterien gebildete Homoexopolysaccharide (HoEPS) sind in verschiedenen Bereichen, beispielsweise in der Zahnplaque oder fermentierten Lebensmitteln, relevant. Für einen gezielten Einsatz in technischen Anwendungen oder in Lebensmitteln und für ihre Vermeidung in der Zahnplaque ist das Wissen über ihre molekulare Struktur und deren Zusammenhang mit den physikochemischen Eigenschaften essentiell. Bis heute sind haupt-sächlich die grundlegenden Strukturen der HoEPS (α-Glucane und β-Fructane) bekannt und Feinstrukturen wurden selten betrachtet. Dies ist unter anderem in analytischen Heraus-forderungen begründet, weshalb in dieser Dissertation die Strukturen von verschiedenen enzymatisch und fermentativ hergestellten HoEPS mit einer Reihe an separat angepassten und weiterentwickelten Analysemethoden detailliert untersucht wurden.

Als wichtige Methode zur Bestimmung der in Polysacchariden enthaltenen glycosidischen Bindungen wurde die Methylierungsanalyse an bakterielle HoEPS angepasst. Anders als bei wasserlöslichen HoEPS erwiesen sich bei wasserunlöslichen α-Glucanen Ultraschall-behandlungen für eine vollständige Methylierung als wichtig. Daneben benötigten α-Glucane harschere Hydrolysebedingungen (2 M Trifluoressigsäure, 121 °C für 60/90 min) als β-Fructane (1 M Trifluoressigsäure, 70 °C für 30 min). Eine Mischung aus wasserlöslichen α-Glucanen und β-Fructanen kann zur Bestimmung der glycosidischen Bindungen der einzelnen HoEPS ohne Auftrennung verwendet werden, wenn zwei Aufarbeitungen mit jeweils optimalen Hydro-lysebedingungen durchgeführt werden.

Neben der Methylierungsanalyse, der Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie und der Mono-saccharidbestimmung wurden die HoEPS und ihre Produkte aus enzymatischen Hydrolysen (endo-Levanase, endo-Mutanase und endo-Dextranase) mittels Hochleistungsanionenaus-tauschchromatographie gekoppelt mit gepulster amperometrischer und massenspektro-metrischer Detektion sowie Hochleistungsgrößenausschlusschromatographie gekoppelt mit Brechungsindexdetektor untersucht.

Zur Untersuchung wasserunlöslicher Glucane wurden fünf Glucansucrasen (GS) von Streptococcus-Bakterien rekombinant hergestellt und zur enzymatischen Glucansynthese eingesetzt. Neben linearen 1,6-verknüpften Dextranen und Glucanen mit einem ausschließlich 1,3-verknüpften, schwach verzweigten Rückgrat wurden gemischt-verknüpfte Glucane erhalten. Die Glucane zweier GS waren 1,3-, 1,6- und 1,3,6-verknüpft und wiesen unter-schiedliche Molekülgrößenverteilungen und Feinstrukturen auf, was die Analysen der Produkte aus endo-Dextranase- und endo-Mutanase-Hydrolysen verdeutlichten. Die Glucane der fünften GS enthielten 1,3-, 1,4und 1,6-Verknüpfungen und hatten damit eine für Streptococcus salivarius-Glucane bisher nicht beschriebene Struktur. Mit Hilfe der endo-Mutanase-Hydrolyse konnte gezeigt werden, dass die 1,3-verknüpften Abschnitte im Vergleich zu denen der anderen untersuchten Glucane abweichende Feinstrukturen aufwiesen. Zur Analyse geordneter Strukturen in den Glucanen kamen Röntgendiffraktion und ¹³C magic angle spinning NMR-Spektroskopie zum Einsatz. Für die 1,3-verknüpften sowie 1,3- und 1,6- verknüpften Glucane wurden starre, kristallähnliche Bereiche beobachtet, die aus 1,3-Glucopyranose-Einheiten aufgebaut waren. Die 1,6-Glucopyranose-Einheiten befanden sich in beweglicheren Bereichen. Dies sind die ersten Beobachtungen von kristallähnlichen Bereichen in von Streptococcus-GS produzierten gemischtverknüpften Glucanen und es existierten bisher keine Einblicke in die Verteilung der glycosidischen Bindungen von gemischt-verknüpften Glucanen in ihren starren, kristallähnlichen oder beweglichen Bereichen.

Die HoEPS von sieben Milchsäurebakterienstämmen der Gattungen Leuconostoc und Liquorilactobacillus wurden fermentativ synthetisiert und wasserunlösliche sowie lösliche HoEPS getrennt aufgereinigt und analysiert. Die relativen und absoluten Ausbeuten an wasserunlöslichen und -löslichen HoEPS der einzelnen Stämme variierten, wobei die wasser-löslichen HoEPS zu unterschiedlichen Anteilen aus Glucanen und Fructanen bestanden. Die entstandenen wasserunlöslichen Glucane hatten copolymerartige Strukturen mit 1,3- und 1,6-verknüpften Abschnitten, die jeweils durch 1,3,6-Glucopyranose-Einheiten verzweigt waren. Der Anteil an häufig mit Wasserunlöslichkeit in Verbindung gebrachten 1,3-Verknüpfungen variierte von 540%. Die wasserlöslichen Glucane waren hauptsächlich 1,6 -verknüpft und hatten ähnliche Strukturen, die mit bekannten Strukturen übereinstimmten. Die Glucane besaßen ungewöhnlich breite Molekülgrößenverteilungen. Bei den Fructanen handelte es sich um teilweise stark verzweigte Levane (Verzweigungsgrade 7-24 %) mit hohen Molekular-gewichten. Durch endo-Levanase wurden verschiedene gemischtverknüpfte Oligosaccharide freigesetzt.

In dieser Arbeit wurden weitere Fructane näher untersucht. Die von einer Inulosucrase synthetisierten Inuline wiesen Verzweigungen und eine breite Molekülgrößenverteilung auf. Ungewöhnliche Fructane mit sowohl 2,1- als auch 2,6Verknüpfungen und Verzweigungen durch 2,1,6-Fructofuranose-Einheiten besaßen ebenfalls hohe Molekulargewichte und wurden fermentativ von Bombella bzw. Enzymen der Glycoside Hydrolase Familie 32 dieser Essig-säurebakterien produziert. Insgesamt unterstreichen die beschriebenen Ergebnisse die Vielfalt der molekularen Strukturen von bakteriellen α-Glucanen und β-Fructanen und verdeutlichen, dass die Kombination angepasster Analysemethoden detaillierte Strukturinformationen liefert. Dementsprechend wurde ein Grundstein für die Ermittlung von Struktur-Wirkungsbeziehungen gelegt, die für eine Anwendung der verschiedenen HoEPS von großer Bedeutung sind.