Synthese, Charakterisierung und Nachweis neuartiger Pyridinium-Proteinmodifikationen

Die vorliegende Dissertation befasste sich mit der posttranslationalen Modifizierung von Proteinen durch reaktive Carbonylverbindungen. Die dabei auftretenden nichtenzymatischen Carbonyl-Amin-Reaktionskaskaden werden unter dem Begriff Maillard-Reaktion zusammen-gefasst und führen zu strukturell vielfältigen Endprodukten, den sogenannten Advanced Glycation Endproducts (AGEs). Die Maillard-Reaktion wird mit negativen Veränderungen von Proteinen in Verbindung gebracht, da diese zum Verlust von essentiellen Aminosäuren führt und die biologische Funktionalität von Proteinen beeinträchtigt. Auf der einen Seite spielen AGEs bei der Herstellung und Verarbeitung von Lebensmitteln eine entscheidende Rolle, auf der anderen Seite werden diese in vivo durch metabolische Prozesse gebildet. Das Verständnis der zugrunde liegenden Reaktionsmechanismen in der Modifizierung von Proteinen ist deshalb von essentieller Bedeutung. Ziel der Arbeit war es daher, in verschiedenen Modellinkubationen die mechanistische Bildung von AGEs zu klären, wobei ein besonderer Fokus auf die Strukturklasse der Pyridinium-AGEs gelegt wurde. Des Weiteren wurde die Bildung dieser Proteinmodifikationen in frittierten Kartoffelchips und gebratenem Fleisch untersucht.

In einer sechsstufigen Synthese wurde ein neuartiges Lysin-Lysin Crosslink (meta-DLP) synthetisiert und dessen Struktur mithilfe verschiedener NMR-Techniken und hochauflösender Massenspektrometrie eindeutig aufgeklärt. Darüber hinaus wurden in einer analogen Synthesestrategie drei weitere monovalente Pyridinium-AGEs (OPLysin, GLAP und HOP-Lysin) hergestellt und charakterisiert. Durch die Entwicklung einer hochsensitiven und leistungsstarken LC-MS/MS Methode, konnten diese Strukturen sicher im Spurenbereich quantifiziert werden. Zunächst konnten auf Grundlage von Modellinkubationen mit N^α-geschütztem Lysin und verschiedenen α Dicarbonylen (Glyoxal (GX) und Methylglyoxal (MGX)) bzw. a-Hydroxycarbonylen (Glycolaldehyd (GA) und Glyceraldehyd (G3)) die Bildung dieser Pyridinium-AGEs aufgeklärt werden. Definierte Versuchsbedingungen wurden durch die Verwendung eines Phosphatpuffers (0,1 M; pH =7,4) gewährleistet und der Einfluss von Sauerstoff (aerobe vs. anaerobe Bedingungen) näher beleuchtet. Nach sieben Tagen Inkubationszeit konnten die höchsten Konzentrationen von meta-DLP (4,42 μmol/mol Lysin) in der Mischinkubation GA/G3 detektiert werden, wobei die Bildung unabhängig von Sauerstoff war. Im Gegensatz dazu wurde OP-Lysin bevorzugt in anaeroben Inkubationen gebildet (aerobe GA-Inkubation: 11,6 μmol/mol Lysin vs. anaerobe GAInkubation: 25,2 μmol/mol Lysin). Desweiteren ließ die Quantifizierung von meta-DLP und OP-Lysin in diesen Inkubationen auf einen neuartigen, alternativen Bildungsmechanismus schließen, wobei GA und GX involviert sind. Diesen Erkenntnissen folgend, wurden Modellinkubationen mit 1-13C-markierten GA durchgeführt und ein Reaktionsweg postuliert, indem zwei Moleküle GA und ein Molekül GX unter Freisetzung von Ameisensäure zur Bildung von meta-DLP bzw. OPLysin führen. Darüber hinaus konnten GLAP und HOP-Lysin als G3- bzw. GAspezifische AGEs bestätigt werden. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass a-Hydroxycarbonyl-verbindungen eine zentrale Rolle bei der Bildung von Pyridinium-AGEs einnehmen. Neben kurzkettigen Carbonylen wurden zudem längerkettige Kohlenhydrate als potentielle Vorläufer-strukturen von Pyridinium-AGEs identifiziert. Gleichermaßen wurden Modellinkubationen unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen durchgeführt. Die quantitativ bedeutsamsten Mengen wurden in anaeroben Inkubationen mit D-Ribose detektiert (OP-Lysin: 23,9 μmol/mol Lysin; meta-DLP: 0,82 μmol/mol Lysin und GLAP: 0,14 μmol/mol Lysin). Darüber hinaus konnten in diesen Modellinkubationen Einblicke in das Redoxsystem GX/GA gegeben werden. Die Reduktion der entsprechenden Imine durch Natriumbordeuterid führte für GA zu einfach deuteriertem N⁶-Hydroxyethyllysin (HEL-1D) und für GX zu zweifach deuteriertem N⁶-Hydroxyethyllysin (HEL-2D). Im Vergleich zur aeroben D-Ribose-Inkubation lag das Verhältnis in der anaeroben Inkubation deutlich zugunsten von GA, was die bevorzugte Bildung der Pyridinium-AGEs erkärte. Eine Ausnahme bildete HOP-Lysin, hier lieferten Inkubationen mit C4-Zuckern im Vergleich zur Inkubation mit D-Ribose bis zu zehnfach höhere Mengen.

Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen ergaben, dass die synthetisierten Pyridinium-AGEs fluoreszierende Strukturen darstellen. In diesem Zusammenhang wurde in weiteren Modellversuchen die photochemische Bildung von Singulett-Sauerstoff näher untersucht. Dazu wurden meta-DLP und OP-Lysin in Gegenwart eines wasserlöslichen Naphthalinderivates (NDP) mit einer Quecksilberdampflampe bestrahlt. Der anschließende Nachweis des korrespondierenden Endoperoxids (NDPO2) mittels LC-MS/MS bewies, dass fluoreszierende Pyridinium-AGEs Photosensibilisatoren darstellen.

Gleichzeitig wurde in kommerziellen Kartoffelchips ein breites AGE-Spektrum quantifiziert. Neben säurestabilen Proteinmodifikationen, die nach einer salzsauren Hydrolyse quantifiziert wurden, konnten auch säurelabile Strukturen nach einer enzymatischen Hydrolyse in isolierten Proteinfraktionen erfasst werden. Hierbei stellte sich heraus, dass die MGX-AGEs (CEL und MOLD) die GX-Pendants (CML und GOLD) um den Faktor 1,4-3 überstiegen. Nichtsdestotrotz konnte N⁶-Formyllysin als quantitativ bedeutendste Proteinmodifikation mit einem durchschnittlichen Gehalt von 950 °g/100 g quantifiziert werden. Durch kollisionsinduzierte Dissoziationsexperimente konnten erstmalig meta-DLP und OP-Lysin in prozessierten Lebensmitteln nachgewiesen und quantifiziert werden. Die durchschnittlichen Gehalte in kommerziellen Kartoffelchips lagen für meta-DLP bei 0,12 °g/100 g und für OPLysin bei 6,9 °g/100 g. Während GLAP in einem ähnlichen Konzentrationsbereich detektiert wurde, konnte die GA-spezifische Proteinmodifikation HOP-Lysin nicht quantifiziert werden. Weiterführende Experimente mit steigender Frittierdauer von Kartoffelscheiben lieferten genauere Einblicke in die Bildung von AGEs und deren Vorläuferstrukturen. Wie bereits oben angesprochen ließ die Detektion von HEL-1D und HEL-2D Rückschlüsse auf proteingebundendes GA bzw. GX schließen, wobei mit fortschreitender Frittierdauer das Verhältnis deutlich zugunsten von GX verschoben wurde. Abschließend wurde die AGE-Bildung in gegrillten Rindfleischbratlingen betrachtet, wobei D-Ribose als potente Vorläuferstruktur im Fokus stand. Allerdings reichten die natürlich vorkommenden Gehalte des C5-Zuckers nicht aus, um Pyridinium-AGEs in quantitativ relevanten Mengen zu bilden. Die Zugabe von DRibose zu den nativen Rindfleischbratlingen führte zu signifikant erhöhten AGEGehalten.

Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Dissertation das bisherige Wissen zur posttranslationalen Modifikation von Proteinen erweitert werden. Durch quantitative Betrachtungen wurden Einblicke in die zugrunde liegenden Bildungsmechanismen von Pyridinium-AGEs gewonnen. Darüber hinaus wurde die Strukturklasse der Pyridinium-AGEs als Auslöser von oxidativen Stress identifiziert und können somit in vivo einen Einfluss auf die Entstehung von Katarakt besitzen. Zudem konnte diese Strukturklasse in thermisch behandelten Lebensmitteln quantifiziert werden.