Effekt kombinierter Lebensmittelinhaltsstoffe der mediterranen Ernährung auf die nukleäre Konzentration von Nrf2 in Caco-2-Zellen – Methodenoptimierung und Anwendung

Während des Lebens ist der Mensch aufgrund des aeroben Stoffwechsels sowie diverser endo- und exogener Faktoren stets einer gewissen Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt. Eine erhöhte Konzentration dieser Verbindungen kann dabei als oxidativer Stress zu massiven Schäden an Biomolekülen wie Lipiden, Proteinen und der DNS führen, welche an der Entstehung und Progression diverser Krankheiten beteiligt sind. Um derartigen Schädigungen entgegenzuwirken, verfügen menschliche Zellen über ein breites Arsenal antioxidativwirksamer Enzyme, deren Expression durch Transkriptionsfaktoren wie Nrf2 initiiert wird. Die nötige Translokation von Nrf2 in den Nukleus kann dabei unter anderem durch Lebensmittelinhaltsstoffe wie Sulforaphan induziert werden.

Neben weiteren Faktoren scheint die Aufnahme von Nrf2-Aktivatoren im Rahmen der mediterranen Ernährung eine gewichtige Rolle bei deren gesundheitsfördernder Wirkung zu spielen. Aus ernährungsphysiologischer Sicht wird der kombinierten Wirkung verschiedener, gleichzeitig aufgenommener Lebensmittelinhaltsstoffe heute dabei meist eine größere Relevanz zugesprochen als den Effekten einzelner Substanzen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher Nrf2-aktivierende Inhaltsstoffe der mediterranen Ernährung auf mögliche kombinatorische Effekte bezüglich der nukleären Nrf2 Konzentration zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden diverse Nrf2Aktivatoren der mediterranen Ernährung mit undifferenzierten Caco-2-Zellen einzeln und in Kombination inkubiert, um anschließend Nrf2 in deren nukleären Extrakten zu quantifizieren. Zur Identifikation möglicher kombinatorischer Effekte war dabei ursprünglich ein Screening mittels Western Blot-Analyse geplant, dessen Ergebnisse anschließend massenspektrometrisch bestätigt werden sollten. Für aussagekräftige Resultate war es zudem wichtig die maximal zulässigen Inkubationskonzentrationen mit Caco-2-Zellen zu bestimmen, weshalb diverse Zytotoxizitätstests in Form von MTT Assays durchgeführt wurden.

Zusammenfassend gelang es im Rahmen dieser Arbeit die geplante Western Blotting-Methode hinsichtlich verschiedener Punkte zu optimieren (z. B. Verwendung monoklonaler Antikörper). Zusätzlich wurde das unregelmäßige Auftreten schwerer zusätzlicher Banden (Molekulargewicht ≥ 250 kDa) untersucht. Der Nachweis kombinatorischer Effekte erfolgte letztlich jedoch ausschließlich massenspektrometrisch per microLC-MS/MS (sMRM). Die dabei genutzte Analysemethode konnte bezüglich der Vermeidung von Niederschlägen und Polyacrylamidgel-Fragmenten optimiert und für die Verwendung von Caco-2-Zellen validiert werden. Des Weiteren gelang es optimierte m/z Werte für die Übergänge des verwendeten internen Standards zu etablieren. Mittels externer Kalibrierung (absolute Nrf2-Quantifizierung) konnten schließlich die mediterranen Lebensmittelinhaltsstoffe Sulforaphan, Thymol, Hydroxytyrosol, Carnosol, Piperin und Diallyltrisulfid bezüglich ihrer Nrf2-aktivierenden Wirkung in Caco-2-Zellen untersucht und diverse kombinatorische Effekte identifiziert werden. Dabei wurden hauptsächlich subadditive Effekte nachgewiesen. Ein additiver bis leicht synergistischer Effekt konnte hingegen für die Kombination aus Carnosol und Sulforaphan beobachtet werden. Auffällig waren zudem die hemmenden Wirkungen von Piperin und Diallyltrisulfid in Kombinationsinkubationen sowie die gegenseitige Hemmung von Carnosol und Hydroxytyrosol.

Insgesamt stellt die in dieser Arbeit optimierte und verwendete massenspektrometrische Analysemethode ein vielversprechendes Instrument zur weiteren Untersuchung kombinatorischer Effekte bezüglich der nukleären Nrf2Konzentration dar. Die erlangten Erkenntnisse belegen zudem die große Relevanz kombinierter Wirkungen gleichzeitig aufgenommener Lebensmittelinhaltsstoffe für die Untersuchung der Nrf2-Aktivierung im Rahmen der mediterranen Ernährung.