Charakterisierung der Reaktionsprodukte verschiedener rekombinanter 4,6-α-Glucanotransferasen

Abstract

4,6-α-Glucanotransferasen sind stärkemodifizierende Enzyme, die Stärke/Maltodextrine in lsomalto-/Malto-Polysaccharide (IMMPs) umwandeln. Dabei spalten sie eine Glucose-Einheit am nichtreduzierenden Ende eines Stärke-/Maltodextrinmoleküls ab und transferieren diese unter der Bildung einer α-1,6-Verknüpfung auf das nichtreduzierende Ende eines zweiten α-1,4-verknüpften Akzeptormoleküls, an dem bei mehrfacher Wiederholung der Reaktion eine längere Kette aus α-1,6-verknüpften Glucopyranosen entsteht. Der Anteil an a-1,6-Verknüpfungen sowie die Länge der α-1,6-verknüpften Abschnitte hängt dabei von dem verwendeten Enzym sowie dem Substrat und potentiell auch von den Reaktionsbedingungen ab. Neben der Transferaseaktivität besitzen 4,6-α-Glucanotransferasen auch eine Hydrolyseaktivität, bei der Wasser als Akzeptormolekül fungiert, was zur Freisetzung des intermediär gebundenen Glucosemoleküls führt. In vorangegangenen Studien wurde die Menge an freigesetzter Glucose jedoch häufig nicht quantifiziert, dazu wurde oft keine detaillierte Charakterisierung der enzymatisch synthetisierten IMMPs vorgenommen.

Das Ziel der Untersuchungen war es daher, die strukturelle Zusammensetzung der Reaktionsprodukte drei verschiedener 4,6-α-Glucanotransferasen im Detail zu untersuchen. Dafür wurden zwei verschiedene Maltodextrine sowie Weizenstärke bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen umgesetzt. Die gebildeten Produkte wurden anschließend mittels ¹H-NMR-Spektroskopie analysiert, wobei die anomeren Signale verschiedener Struktureinheiten mithilfe von Standardsubstanzen und 2D-Experimenten identifiziert wurden. Über die Integrale der jeweiligen Signale konnten die Anteile der vorliegenden Verknüpfungen und der freigesetzten Glucose ermittelt werden. Zusätzlich wurden ausgewählte Produkte über eine enzymatischchromatographische Fingerprint-Analyse analysiert, bei der die 1-1,4-verknüpften Anteile der IMMPs enzymatisch vollständig hydrolysiert und die Hydrolyseprodukte mittels Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) vermessen werden. Ein Vergleich der Peakflächen ausgewählter Signale zeigt deutliche Unterschiede in der Längenverteilung der a-1,6-verknüpften Abschnitte. Eine Nachverfolgung der Reaktion über die Analyse der Reaktionsmischung bei verschiedenen Zeitpunkten lieferte zudem detaillierte Informationen über den Verlauf der Reaktion sowie die Umsetzung verschiedener Substrate. Somit konnte ein verbessertes Verständnis der Struktur und Bildung von IMMPs durch rekombinante 4,6-1-Glucanotransferasen erhalten werden.