HILIC-PDA(-MS) basierte Methode zur Analyse von (methylveresterten) ungesättigten Galacturonsäure-Oligosacchariden

Abstract

Für Pektine und deren Oligosaccharide sind diverse positive ernährungsphysiologische Eigenschaften, wie präbiotische Effekte, postuliert. In der Lebensmittelindustrie finden Pektine ihren Einsatz als Geliermittel, Stabilisatoren und Verdickungsmittel. Die funktionellen und ernährungsphysiologischen Eigenschaften der Pektine und ihren Oligosacchariden hängen von ihrer Feinstruktur ab. Ein zentrales Strukturelement der Pektine sind Homogalacturonane. Diese sind aus a-1,4-verknüpften Galacturonsäuren aufgebaut, die acetyliert und/oder methyliert vorliegen können. In Abhängigkeit vom Methylierungsgrad (DM) können Pektin-/Pektatlyasen ungesättigte Galacturonsäure-Oligosaccharide (uGalA-OS) aus den Homogalacturonanen freisetzen. Zur Analyse dieser uGalA-OS wurde eine HILIC-PDA(-MS) basierte Methode entwickelt und validiert. Mit dieser können (methylveresterte) uGalA-OS im ersten Ansatz nach alkalischer Hydrolyse entsprechend ihres Polymerisierungsgrads (DP) quantifiziert werden und im zweiten Ansatz zusätzlich hinsichtlich ihres nativen DM und Methylierungsmusters charakterisiert werden.

Zunächst wurden zwölf unveresterte uGalA-OS (DP = 2-13) als Standardsubstanzen isoliert und charakterisiert. Die mit Hilfe der Standardsubstanzen entwickelte chromatographische Methode besteht aus der Trennung der uGalA-OS auf einer amidbasierten stationären Phase und deren anschließenden Detektion mittels PDA. Für die unveresterten uGalA-OS wurden im Verhältnis zu Acarbose als interne Standardsubstanz bei 235 nm relative Responsefaktoren (RRF) innerhalb eines festgelegten linearen Konzentrationsbereichs (10/28-100 pM) ermittelt. Diese RRF ermöglichen eine (semi-)quantitative Bestimmung von (methylveresterten) uGalA-OS sowie die Übertragbarkeit in andere Labore. Die zusätzliche Detektion mit einem Single Quadrupol-MS macht es möglich den DP und DM der uGalA-OS zu bestimmen bzw. zu verifizieren. Zusätzlich können mittels Orbitrap-MS die Positionen der Methylgruppen in den uGalA-OS identifiziert werden.

Die entwickelte Methode erwies sich für verschiedene Anwendungen als geeignet. Zum einen konnte die Spezifität einer Pektinlyase durch die Analyse von aus kommerziellem Zitruspektin freigesetzten uGalA-OS charakterisiert werden. Hierbei zeigte sich, dass die Pektinlyase an den Spaltungsstellen -1 und +2 eine Methylgruppe bevorzugte, während sie an der Spaltungsstelle +1 keine Methylgruppe akzeptierte. Zum anderen konnten in enzymatisch behandeltem Karottentrester verschiedene methylveresterte uGalA-OS (DP = 2-12) identifiziert werden. Enzymatisch behandelter Karottentrester kann als pektinreicher Lebensmitteinebenstrom anderen Lebensmitteln zugesetzt werden, um deren ernährungsphysiologisches Potential zu steigern.