Identifizierung eines Kandidatenproteins für die Hydrolyse von Isothiocyanaten zu Aminen in Brassicaceae-Gemüse

Abstract

Isothiocyanate (ITC) werden aus Glucosinolaten gebildet und sind aufgrund ihrer antimikrobiellen, antiinflammatorischen und krebspräventiven Eigenschaften von ernährungsphysiologischem Interesse.^[1] Allerdings können ITC in Kohl enzymatisch zu Aminen abgebaut werden, jedoch ist der zugrundeliegende pflanzeneigene Stoffwechselweg bisher unbekannt.^[2] Ziel dieses Projektes ist daher die Identifizierung und Charakterisierung der ITC-Hydrolase (ITCase), die am enzymatischen Abbau der ITC beteiligt ist.

Kommerzielle Brassicaceae-Gemüse wurden auf ITCase-Aktivität untersucht, indem die Umwandlung von 3-Butenyl ITC zum korrespondierenden Amin mittels LC-MS/MS MRM^[2] quantifiziert wurde. Dabei zeigten Rosenkohl und Brokkoli die höchste Enzymaktivität. Zur Identifizierung der ITCase wurden die Proteine aus gefriergetrocknetem Rosenkohl wässrig extrahiert, mittels Ammoniumsulfat-Fällung und chromatographischer Methoden getrennt und die Fraktionen auf enzymatische Aktivität untersucht. Die in den positiven Proben vorliegenden Proteine wurden mittels nanoLC-HRMS im Bottom-Up-Verfahren identifiziert. Zusätzlich wurde die Aktivität der ITCase in Kohlrabi-Organen zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien untersucht. Die Enzymaktivität wurde mit Proteinexpressionsmustern korreliert, wobei die Abundanz von sechs Proteinen mit der Enzymaktivität übereinstimmte. Von diesen Kandidatenproteinen konnte eines in den vorhergehenden Isolierungsansätzen in Rosenkohl nachgewiesen werden, sodass nun mittels heterologer Proteinexpression in Escherichia coli die Funktionalität dieses Proteins verifiziert wird.