Chemoreception of bacterial metabolites by odorant receptors of the nose and class C GPCRs in blood leukocytes Chemorezeption bakterieller Metaboliten durch Geruchsrezeptoren der Nase und Klasse C-GPCRs in Blutleukozyten

Abstract

Das menschliche Immunsystem ist ein komplexes und hochentwickeltes sensorisches System aus interagierenden Zellen und zahlreichen Botenstoffen, mit der Fähigkeit ,nicht-Selbst’ von ,Selbst’ zu unterscheiden. Es empfängt, verarbeitet und bewertet kontinuierlich Informationen, die es nach Stimulation durch potenziell gefährliche Chemikalien und Krankheitserreger aus der inneren und äußeren Umgebung des Organismus von Rezeptoren erhält. Jüngste Studien zeigten, dass G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) auf Blutleukozyten, wie Rezeptoren für freie Fettsäuren (FFAR), Chemokinrezeptoren, Komplementrezeptoren oder Formylpeptidrezeptoren eine grundlegende Rolle im angeborenen und adaptiven Immunsystem spielen, indem sie Krankheitserreger erkennen, Zellen zum Ort der Verletzung oder Infektion leiten und so die Immunantwort koordinieren. Chemosensorische GPCRs wie die Geschmacksrezeptoren TAS1Rs und TAS2Rs sowie Geruchsrezeptoren scheinen ebenfalls Teil der molekularen Ausrüstung zu sein, mit deren Hilfe sich Immunzellen in chemischen Gradienten orientieren. Genexpressionsstudien wiesen die Anwesenheit von Geruchsrezeptoren, aller 25 TAS2Rs und den drei TAS1Rs auf fünf verschiedenen Typen menschlicher Blutleukozyten nach, wo insbesondere die Geschmacksrezeptoren mitunter an der Chemotaxis menschlicher Neutrophiler und dem Schutz von T-Zellen vor dem aktivierungsbedingten Zelltod beteiligt sind. Zudem scheinen chemosensorische GPCRs in verschiedenen mikrobiomexponierten Grenzepithelien bspw. im Magen-Darm-Trakt bzw. den Atemwegen eine Art Sensorfunktion des innaten Immunsystems einzunehmen. Gemeinsam mit den TAS1Rs und einigen weiteren Rezeptoren bilden die metabotropen Glutamatrezeptoren (GluRs) die Klasse C der GPCRs, die mitunter die Fähigkeit besitzen, innerhalb ihrer Familien Heterodimere zu bilden. So führt die Heterodimerisierung zwischen TAS1Rs zum Süßgeschmacks- (TA1R2/TAS1R3) bzw. Umami-Geschmacksrezeptor (TAS1R1/TAS1R3) mit effektiv unterschiedlichen Ligandenspektren. Zudem wiesen neuere Studien mit Hilfe von heterologen Expressionsanalysen eine physische Interaktion verschiedener mGluRs sowie eine Funktionalität einzelner Heterodimere nach, deren zellulären Bedeutungen jedoch noch weitestgehend unklar sind. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe molekularund zellbiologischer Methoden der Frage nachgegangen, ob Rezeptoren über Klasse-C-GPCR-Familien hinweg die Möglichkeit zur Bildung von Heterodimeren auf humanen Blutleukozyten besitzen. Genexpressionsanalysen lieferten in einem ersten Schritt den Nachweis über die Anwesenheit aller acht metabotropen Glutamatrezeptoren und der drei TAS1Rs in PMNs (Polymorphkernige Leukozyten) und T-Zellen, welche die Grundlage für mögliche physische Rezeptorinteraktionen bildete. Dabei manifestierten sich GRM2 und TAS1R3 als die Gene mit den jeweils höchsten Transkriptniveaus innerhalb ihrer Rezeptorfamilien, deren Expressionsraten sich nach 24-stündiger Inkubation mit Mononatriumglutamat (MSG), einem Agonisten sowohl für mGluRs als auch den Umami-Rezeptor TAS1R1/TAS1R3, um ein bis zu 2,4-faches steigerten. Proteinanalysen von mGluR2 und TAS1R3 erbrachten mit Hilfe der Immunzytochemie und überlagernder Proteinsignale einen ersten Beleg für eine Co-Expression beider Rezeptoren in PMNs und in heterologen HEK-293 Zellen anhand eines BRET-Assays den Nachweis derer physischen Interaktion. Co-Immunopräzipitationen und Western Blots aus Proteinlysaten isolierter humaner PMNs und T-Zellen bestätigten schließlich die Anwesenheit beider Rezeptorproteine und lieferten einen eindeutigen Beweis für Protein-Protein-Interaktionen zwischen mGluR2 und TAS1R3 in beiden Blutzelltypen. Für die darauffolgende Funktionsanalyse des Heterodimers konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein bereits für die Identifizierung von Geruchsrezeptoren und derer Agonisten bestehender cAMP-Lumineszenzassay in HEK-293 Zellen so modifiziert werden, dass dessen Anwendbarkeit für die funktionale Charakterisierung von mGluR2/TAS1R3 reproduzierbar gegeben war. Konzentrations-Wirkungsbeziehungen des Heterodimers mit MSG offenbarten im cAMP-Lumineszenzassay ein gegenüber dem Homodimer mGluR2 potenteres Rezeptorkonstrukt mit signifikant geringeren IC50Werten. Gleichzeitig wies das Heterodimer eine zu mGluR2 signifikant höhere Oberflächenexpression in transfizierten HEK-293 Zellen auf, die rückschlüssig einen Hinweis auf eine mögliche Chaperonfunktion von TAS1R3 im Dimer mit mGluR2 in Form eines erleichterten Transports des Rezeptors zur Zellmembran lieferte. Mit Hilfe von rezeptorspezifischen Antagonisten konnte ferner gezeigt werden, dass das Heterodimer mit für eine MSG-induzierte Erleichterung der durch N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLF) stimulierten IL-8-Sekretion in PMNs verantwortlich ist und folglich an der Modulation von Immunantworten involviert zu sein scheint. Im Zusammenhang mit der funktionellen Analyse von mGluR2/TAS1R3 stellte sich hierauf die Frage nach möglichen potentiellen Agonisten. Während ein erstes Aminosäure-Screening aller L- und D-Aminosäuren mit Ausnahme von l-Glutamat keine heterodimerspezifische Rezeptorantwort hervorbrachte, lieferte in einem Screen bestehend aus 14 bakteriellen Überständen unterschiedlicher Spezies der Überstand von Pseudomonas aeruginosa ein im Vergleich zu mGluR2 signifikant stärkeres Rezeptorsignal. Nachfolgende Analysen charakterisierten die unbekannte(n) Substanz(en) als sehr polare Verbindung(en) mit einer Größe von unter einem kDa. Fraktionierungen des bakteriellen Überstandes in 22 Subfraktionen mittels HPLC führten anschließend zur Identifizierung von einer für die Rezeptorantwort verantwortlichen Sub-fraktion, deren Charakterisierung in nachfolgenden Studien anhand von HPLC-, NMR- und cAMP Lumineszenz-Analysen zur Identifizierung des/der entsprechende(n) Agonist(en) erfolgen muss.

Daneben lieferte ein durchgeführtes Screening bekannter, im Überstand von P. aeruginosa bereits beschriebener Virulenzmoleküle mit PQS und der cis-2-Dezensäure zwei potentielle Agonisten für den TAS1R3 Rezeptor, deren mögliche Interaktionspartner, in erster Linie TAS1R1 bzw. TAS1R2, sowie deren immunologische Funktionen in weiterführenden Analysen ebenfalls aufgeklärt werden müssen. Jedoch scheinen unter den chemosensorischen GPCRs nicht nur Geschmacksrezeptoren mit bakteriellen Molekülen bzw. Metaboliten interagieren und dadurch einen Einfluss auf die menschliche Physiologie nehmen zu können. Mehrere Studien aus den vergangenen Jahren berichten von einer Interaktion verschiedener Geruchsrezeptoren mit bakteriellen Metaboliten und einer damit einhergehenden Induktion von Mikroglia-Aktivierungen, der Renin-Sekretion und Blutdruckregulation sowie einer erhöhten Sekretion des anorektischen Darmhormonpeptids YY. Ein wesentliches Problem bei der Identifizierung möglicher Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen stellt in diesem Zusammenhang jedoch die Zuordnung von Geruchsrezeptoren zu ihren entsprechenden Agonisten dar, die einen immensen Beitrag zur Aufklärung physiologischer Prozesse liefern würden. Bis heute konnten lediglich für etwa 15% der funktionalen humanen Geruchsrezeptoren rezeptorspezifische Liganden identifiziert werden. Mit Hilfe eines bidirektionalen Screening-Ansatzes gelang es in der vorliegenden Arbeit, den aus Bodenbakterien stammenden Metaboliten Geosmin als spezifischen Agonist für den Geruchsrezeptor OR11A1 zu identifizieren. Vergleiche der Rezeptorantworten gegenüber Geosmin zwischen sechs verschiedenen Spezies wiesen seine evolutionär konservierte Rezeptorfunktion nach. Dabei zeigte der Rezeptor der Wüsten-Kängururatte (doOR11A1) im Vergleich zum menschlichen Ortholog eine mehr als 100-fach höhere Sensitivität. Extrakte aus geosmin-produzierenden Stämmen von Streptomyces albus und Streptomyces albidoflavus, deren Geosminkonzentrationen mittels GC-GC-HRMS exakt quantifiziert wurden, lieferten eine eindeutige Rezeptorantwort von doOR11A1, die es der Känguru-Ratte ermöglicht, Geosmin im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich wahrzunehmen.

Die Ergebnisse aus der vorliegenden Arbeit über den Nachweis eines funktionellen Heterodimers mGluR2/TAS1R3 in humanen Blutleukozyten sowie der Identifizierung von (bisher unbekannten) bakteriellen Metaboliten als mögliche Agonisten für chemosensorische Rezeptoren liefern einen Beitrag zur Aufklärung und zu einem besseren Verständnis über deren außer-ordentlichen, funktionellen Beitrag dieser Proteine im gesamten menschlichen Körper. Dies birgt enormes Potential für diverse Anwendungsbereiche der Medizin, Ernährungsforschung sowie für biotechnologischer Verfahren und könnte langfristig neue Möglichkeiten in Hinblick auf gezielte Interventionsmöglichkeiten eröffnen.

The human immune system is a complex and highly developed sensory system consisting of interacting cells and numerous messenger substances, with the ability to discriminate ‘non-self’ from ‘self‘. It continuously receives, processes and evaluates information from receptors after stimulation by potentially dangerous chemicals and pathogens from the organism's internal and external environment. Recent studies have shown that G protein-coupled receptors (GPCRs) on blood leukocytes, such as free fatty acid receptors (FFAR), chemokine receptors, complement receptors or formyl peptide receptors, play a fundamental role in the innate and adaptive immune system by recognising pathogens, directing cells to the site of injury or infec-tion and thus coordinating the immune response. Chemosensory GPCRs such as the taste receptors TAS1Rs and TAS2Rs as well as olfactory receptors also appear to be part of the molec-ular equipment that enables immune cells to orientate themselves within chemical gradients. Gene expression studies demonstrated the presence of odorant receptors, all 25 TAS2Rs and the 3 TAS1Rs on 5 different types of human blood leukocytes, where the taste receptors in particular are involved in the chemotaxis of human neutrophils and the protection of T cells from activation-induced cell death. In addition, chemosensory GPCRs in various microbiome-exposed border epithelia, e.g. in the gastrointestinal tract or respiratory tract, appear to fulfil a sensory function of the innate immune system. Together with the TAS1Rs and some other receptors, the metabotropic glutamate receptors (GluRs) form class C of GPCRs, which have the ability to form heterodimers within their families. Thus, heterodimerisation between TAS1Rs leads to the sweet taste receptor (TA1R2/TAS1R3) or umami taste receptor (TAS1R1/TAS1R3) with effectively different ligand spectra. In addition, recent studies using heterologous expression analyses demonstrated a physical interaction of different mGluRs as well as a functionality of individual heterodimers, the cellular significance of which, however, is still largely unknown. In the present study, molecular and cell biological methods were used to investigate whether receptors across class C GPCR families have the ability to form heterodimers on human blood leukocytes. In a first step, gene expression analyses provided evidence for the presence of all eight metabotropic glutamate receptors and the three TAS1Rs in PMNs (polymorphonuclear leukocytes) and T cells, which formed the basis for possible physical receptor interactions. GRM2 and TAS1R3 were found to be the genes with the highest transcript levels within their receptor families, and their expression levels increased up to 2.4fold after 24 h incubation with monosodium glutamate (MSG), an agonist for both mGluRs and the umami receptor TAS1R1/TAS1R3. Protein analyses of mGluR2 and TAS1R3 provided initial evidence of co-ex-pression of both receptors in PMNs using immunocytochemistry and overlapping protein signalling, and evidence of their physical interaction in heterologous HEK-293 cells using a BRET assay. Finally, coimmunoprecipitations and Western blots of proteins from isolated human PMNs and T-cells confirmed the presence of both receptor proteins and provided strong evidence for protein-protein interactions between mGluR2 and TAS1R3 in both blood cell types. For the subsequent functional analysis of the heterodimer, a cAMP luminescence assay already used for the identification of olfactory receptors and their agonists could be modified in HEK-293 cells within the scope of the present work in such a way that its applicability for the functional characterisation of mGluR2/TAS1R3 was reproducible. Concentration-response relationships of the heterodimer with MSG revealed a more potent receptor construct with significantly lower IC₅₀ values compared to the homodimer mGluR2 in the cAMP luminescence as-say. At the same time, the heterodimer showed a significantly higher surface expression com-pared to mGluR2 in transfected HEK-293 cells, which provided conclusive evidence for a possible chaperone function of TAS1R3 in the dimer with mGluR2 in the form of facilitated transport of the receptor to the cell membrane. Using receptor-specific antagonists, it was further shown that the heterodimer is involved in MSG-induced facilitation of N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLF)-stimulated IL-8 secretion in PMNs and consequently appears to be implicated in the modulation of immune responses. In the context of the functional analysis of mGluR2/TAS1R3, this raised the question of possible potential agonists. While an initial amino acid screen of all L - and d-amino acids, with the exception of L-glutamate, did not produce a heterodimerspecific receptor response, in a screen consisting of 14 bacterial supernatants of different species, the supernatant from Pseudomonas aeruginosa produced a significantly stronger receptor signal compared to mGluR2. Subsequent analyses characterised the unknown substance(s) as polar compound(s) with a size of less than one kDa. Fractionation of the bacterial supernatant into 22 subfractions by HPLC subsequently led to the identification of a subfraction responsible for the receptor response, which will be characterised in subsequent studies using HPLC, NMR and cAMP luminescence analyses to finally identify the corresponding agonist(s). In addition, a screening of known virulence molecules already described in the supernatant of P.aeruginosa yielded two potential agonists for the TAS1R3 receptor in the form of PQS andcis-2-decenoic acid, whose possible interaction partners, primarily TAS1R1 and TAS1R2, aswell as their immunological functions, must also be elucidated in further analyses.

However, among the chemosensory GPCRs, not only taste receptors appear to interact with bacterial molecules or metabolites and thereby exert an influence on human physiology. Sev-eral studies from recent years have reported an interaction of various odorant receptors with bacterial metabolites and an associated induction of microglia activation, renin secretion and blood pressure regulation as well as an increased secretion of the anorectic intestinal hormone peptide YY. A major problem in the identification of possible receptor-ligand interactions in this context, however, is the assignment of odorant receptors to their corresponding agonists, which would make an immense contribution to the elucidation of physiological processes. To date, receptor-specific ligands have only been identified for about 15% of functional human odorant receptors. Using a bidirectional screening approach, the present study was able to identify the soil bacteria-derived metabolite geosmin as a specific agonist for the odorant receptor OR11A1. Comparisons of the receptor responses to geosmin between six different species demonstrated its evolutionarily conserved receptor function. The receptor of the desert kangaroo rat (doOR11A1) showed a more than 100 -fold higher sensitivity compared to the human orthologue. Extracts from geosmin-producing strains of Streptomyces albus and Streptomyces albidoflavus, whose geosmin concentrations were quantified exactly by GC-GC-HRMS, showed a unique receptor response of doOR11A1, which enables the kangaroo rat to perceive geosmin in the low nanomolar concentration range.

The results of the present work on the detection of a functional heterodimer mGluR2/TAS1R3 in human blood leukocytes as well as the identification of (previously unknown) bacterial metabolites as possible agonists for chemosensory receptors provide an contribution to the elucidation and better understanding of the incredible functional contribution of these proteins in the entire human body. This offers enormous potential for various areas of application in medicine, nutritional research and biotechnological processes and could open up new possibilities in the future with regard to targeted interventions.