DBS/HRMS : un couplage adapté à la toxicologie médicolégale post-mortem

Objectif

Développer une méthode de criblage toxicologique utilisant la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (GC-HRMS) à partir de gouttes de sang séché (Dried Blood Spot [DBS]), et l’appliquer à des cas réels post-mortem.

Méthode

Vingt-cinq microlitres de sang total ont été déposés et séchés sur une carte en papier de type Whatmann 903. Après une étape de séchage de 2 h, le spot a été découpé dans sa totalité. Les composés ont été désorbés du papier grâce à un passage aux ultrasons en présence de tampon phosphate (pH = 8,4) puis extraits à l’aide d’un mélange de solvants organiques dichlorométhane/chloroforme/hexane/isopropanol (80:10:6,6:3,4 v/v/v/v). L’extrait était acétylé avant d’être analysé par GC-HRMS. Les composés étaient séparés par un gradient de température sur une colonne HP5MS (30 m × 25 μm × 25 mm). Le détecteur était utilisé en mode full scan (50 à 500 m/z ; 60 000 Hz). Les spectres de masse étaient identifiés grâce à une bibliothèque interne au laboratoire. Afin d’évaluer les performances de la méthode, les limites de détection (LDD) et d’identification (LDI) ont été déterminées pour 22 des composés les plus fréquemment détectés dans les échantillons de sang post-mortem au laboratoire en 2022 : cocaïne, ecgonine méthylester, méthadone, EDDP, morphine, codéine, kétamine, norkétamine, MDMA, MDA, diazépam, nordazépam, oxazépam, midazolam, paracétamol, tramadol, O-desméthyltramadol (ODT), N-desméthyltramadol (NDT), amitriptyline, cyamémazine, sertraline et norsertraline. La sélectivité de la méthode était évaluée par l’analyse de 10 sangs post-mortem négatifs issus de sources différentes. La stabilité sur DBS a été étudiée à 3 températures (–20 °C, +4 °C et +20 °C) pendant 15 jours. La méthode a ensuite été appliquée à 102 échantillons de sang post-mortem. Les résultats ont été comparés aux deux méthodes de criblage classiques mises en œuvre au laboratoire (extraction liquide-liquide de 1 mL de sang total et analyse par LC-DAD/MS et GC-MS).

Résultats

La méthode s’est révélée sélective et sensible avec des LDD comprises entre < 10,0 ng/mL et 20,0 ng/mL. Les LDI mesurées correspondaient à la gamme de concentration thérapeutique pour chaque composé ou à une valeur n’entraînant pas d’intoxication aiguë (stupéfiants). Dans l’ensemble, les composés étaient considérés stables au cours des 15 jours à toutes les températures testées, à l’exception du midazolam et du tramadol et de ses métabolites. La comparaison des analyses de 102 échantillons post-mortem a permis d’identifier 239 composés, correspondant à 74 composés, dans 70 cas positifs. La méthode de criblage toxicologique développée associant échantillonnage DBS et analyse par GC-HRMS a permis d’identifier plus de 20 % de composés supplémentaires par rapport aux techniques classiques mises en œuvre, malgré une prise d’essai d’un volume 40 fois plus faible.

Discussion-Conclusion

L’utilisation du DBS comme support d’échantillonnage dans le domaine clinique est bien établie mais les applications post-mortem sont plus limitées. L’application de la méthode DBS/GC-HRMS à une centaine de cas réels a démontré sa capacité à répondre aux contraintes de faible volume d’échantillon, de sensibilité et de facilité de conservation notamment dans les cas où la disponibilité du sang est limitée. Le DBS semble donc être un mode d’échantillonnage tout à fait adapté au criblage toxicologique dans un contexte de détermination des causes de la mort.