Criblage toxicologique par chromatographie gazeuse haute résolution : application à des échantillons DBS postmortem

Objectifs

Mettre au point une analyse de criblage toxicologique par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (GC-HRMS) à partir de goutte de sang postmortem séché (Dried blood spot: DBS) et l’appliquer à des cas réels.

Méthode

Du sang postmortem (25 μL) était déposé sur une carte en papier de type Whatmann 903. Un séchage de 2 heures à l’obscurité et température ambiante était respecté avant la découpe du spot entier. La désorption des composés d’intérêt était réalisée par un tampon phosphate à pH 8,4, suivie d’une extraction par l’ajout d’un mélange organique dichlorométhane/chloroforme/hexane/isopropanol (80:10:6,6:3,4 v/v/v/v). Après centrifugation (5 min, 12 000 g), la phase organique était évaporée à sec sous flux d’azote. L’extrait était finalement acétylé avant d’être injecté en GC-HRMS. Les composés étaient séparés par un gradient de température sur une colonne HP5MS (30 m × 25 μm × 25 mm). Le détecteur était utilisé en mode full scan (50 à 500 m/z) à une résolution de 60 000 Hz. Les spectres de masse étaient identifiés grâce à une bibliothèque interne. Afin d’évaluer les performances de la méthode, les limites de détection (LOD) et d’identification (LOI) étaient déterminées pour 20 des composés les plus détectés dans des échantillons de sang postmortem au laboratoire en 2022 : cocaïne, ecgonine methylester, méthadone, EDDP, morphine, codéine, kétamine, norkétamine, MDMA, MDA, diazépam, nordazépam, oxazépam, midazolam, paracétamol, tramadol, amitriptyline, cyamémazine, sertraline et norsertraline. La sélectivité de la méthode était évaluée par l’analyse de 10 sangs postmortem négatifs issus de sources différentes. La stabilité des composés était étudiée sur la carte à − 20 °C, + 4 °C et température ambiante durant 7 jours. La méthode développée était appliquée à 103 échantillons de sang postmortem issus de sujets décédés pour lesquels une toxicologie de référence était requise. Le sang était déposé sur une carte à l’arrivée des échantillons au laboratoire. Les résultats étaient comparés aux deux méthodes de criblage classiques mises en œuvre au laboratoire (extraction liquide-liquide de 1 mL de sang total et analyse par LC-DAD/MS et GC-MS).

Résultats

Concernant l’évaluation des performances de la méthode, aucun des 20 composés d’intérêt n’était identifié lors de l’analyse des blancs. L’ensemble des LOD était compris entre < 10 ng/mL et 20 ng/mL. Les LOI étaient comprises dans la gamme de concentration thérapeutique de chaque composé étudié ou à une valeur n’entraînant pas d’intoxication aiguë (stupéfiants). Globalement, les composés étaient stables durant les 7 jours à toutes les températures testées excepté la sertraline et la norsertraline pour lesquelles une meilleure stabilité était observée à − 20 °C. Par ailleurs, il était observé une diminution de la stabilité dès le jour 4 pour la kétamine et le tramadol dans l’ensemble des conditions. La comparaison des criblages de 103 échantillons postmortem a permis un total de 239 identifications, correspondant à 60 composés différents, pour 83 cas positifs. Dans 20 cas, aucun composé n’était identifié. Respectivement 54 et 56 % des composés étaient détectés par les criblages LC-DAD/MS et GC-MS, alors que l’approche DBS-GC-HRMS identifiait 85 % des substances.

Conclusion

L’utilisation de DBS comme support de prélèvement dans le domaine clinique est très reconnue. L’application au postmortem est plus restreint, même si de récentes études ont démontré son intérêt (Gaulier JM et al. Toxicol Anal Clin 2023;35:S25). L’application de la méthode mise au point (DBS-GC-HRMS) à une centaine de cas postmortem a prouvé sa capacité à répondre aux contraintes de faibles volumes, de sensibilité et de praticité de conservation pour des affaires urgentes ou des cas avec peu de disponibilité de sang. Par ailleurs, sa facilité de mise en œuvre et sa rapidité d’exécution en fait une méthode aisément applicable en routine.