Inhibition of human keratocyte proliferation following the transfection of cyclinD1 antisense gene

目的 探讨反义cyclinD1基因转染后人角膜基质细胞增生的改变.方法 人角膜组织来源于北京大学第一医院眼库体外培养人角膜基质细胞,采用第2代或第3代细胞用于实验.利用阳离子脂质体lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染入体外培养的人角膜基质细胞.同时设非转染组(以PBS代替cyclinD1质粒及lipofectamine)及lipofectamine转染组(以PBS代替反义cyclinD1质粒)作为对照.应用免疫细胞化学法观察lipofectamine介导反义cyclinD1基因转染对人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白表达的影响,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察其对人角膜基质细胞增生的影响,并用质量分数0.5%锥虫蓝染色观察活细胞比率.结果 非转染组和lipofectamine转染组均有大量人角膜基质细胞的细胞核cyclinD1染色呈棕褐色,反义cyclinD1转染组只有少量人角膜基质细胞细胞核cyclinD1染色呈棕褐色.与非转染组和lipofectamine转染组比较,反义cyclinD1转染组在转染后2、6、10d cyclinD1蛋白在培养的人角膜基质细胞中的表达明显降低,差异均有统计学意义(t=6.050、t=5.180、t=5.040,P＜0.01;t=6.190、t=5.670、t=5.010,P＜0.01),而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义(t=1.120、t=1.310、t=1.010,P＞0.05).转染后2、6、10d,反义cyclinD1转染组人角膜基质细胞的A570值分别低于非转染组和lipofectamine转染组,差异均有统计学意义(t=5.830、t=5.210、t=4.920,P＜0.01;t=5.130、t=5.010、t=4.850,P＜0.01),说明抑制了基质细胞的增生,而非转染组与lipofectamine转染组间比较,差异均无统计学意义(t=1.110、t=1.230、t=1.120,P＞0.05).0.5%锥虫蓝染色显示各组活细胞比率均在90%以上,未见明显的细胞毒性.结论 阳离子脂质体介导的反义cyclinD1基因转染在转染后一定时间内可降低人角膜基质细胞中cyclinD1蛋白的表达,抑制人角膜基质细胞的增生,未见明显细胞毒性,为角膜基质过度愈合反应的基因治疗奠定了基础。