Gluconsäure bildende Enzyme bei Aspergillus niger

Abstract

At least three gluconic acid forming enzymes were identified in cell-free extracts of Aspergillus niger: glucose oxidase (EC 1.1.3.4), a glucose dehydrogenase (EC 1.1.99.10), and an enzyme or a mixture of enzymes catalyzing the cleavage of 6-phosphogluconate into gluconate and inorganic phosphate. 2,6-dichlorphenolindophenol was one of the hydrogen acceptors in vitro of the glucose dehydrogenase. Some properties of this enzyme (K_m values, pH-dependence, substrate and hydrogen acceptor specificity), as determined in cell-free extracts, were found to be in good agreement with properties described in literature for a glucose dehydrogenase which has been purified from Aspergillus oryzae. The formation of P_i from 6-phosphogluconate and other phosphate esters was found to have an optimum between pH 7 and 8, and another below pH 4. This suggests that it is catalyzed by an alkaline and an acid phosphomonoesterase (EC 3.1.3.1, 3.1.3.2), both enzymes exhibiting only low substrate specificity. The influence of extraction and assay buffers on the activity of gluconate forming enzymes was investigated. Loss of activity during preparation of cell-free extracts, as calculated from loss of activity during storage of cell-free extracts at 4 °C, was found to be lower than 4%. Purified glucose oxidase added before homogenization was found in the extract almost quantitatively.

Im zellfreien Extrakt von Aspergillus niger wurden mindestens drei Gluconsäure bildende Enzyme gefunden: Die Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4), eine Glucosedehydrogenase (EC 1.1.99.10) und ein Enzym oder Enzymgemisch, das die Spaltung von 6-Phosphogluconat in Gluconat und anorganisches Phosphat katalysiert. 2,6-Dichlorphenolindophenol war einer der Wasserstoffakzeptoren für die Glucosedehydrogenase in vitro. Einige Eigenschaften dieses Enzyms (K_m-Werte, pH-Abhängigkeit, Substrat- und Wasserstoffakzeptorspezifität), bestimmt unter Einsatz von zellfreiem Extrakt, stimmten gut mit entsprechenden Eigenschaften überein, die in der Literatur für eine aus Aspergillus oryzae gereinigte Glucosedehydrogenase beschrieben wurden. Die Freisetzung von P_i aus 6-Phosphogluconat und anderen Phosphatestern hatte ein Optimum im Bereich zwischen pH 7 und 8, ein zweites im Bereich unterhalb von pH 4. Dies läßt vermuten, daß sie durch eine relativ substratunspezifische alkalische und saure Phosphomonoesterase (EC 3. 1. 3. 1, 3.1.3.2) katalysiert wird. Der Einfluß von Konzentration und pH-Wert von Extraktions- und Testpuffern auf die Aktivität der Gluconsäure bildenden Enzyme wurde untersucht. Der Aktivitätsverlust während der Herstellung des zellfreien Extraktes, bestimmt durch Extrapolation aus dem Aktivitätsverlust während der Aufbewahrung des Extraktes bei 4 °C, lag unter 4%. Gereinigte Glucoseoxidase, die vor der Homogenisierung zum Mycel zugesetzt worden war, wurde im Extrakt fast quantitativ wiedergefunden.