Relative estimation of common wheat DNA in pasta by digital PCR

Abstract

С 1 августа 2024 г. вступают в силу изменения к ГОСТ 31743-2017, ограничивающие примесь мягкой пшеницы в макаронных изделиях группы А долей до 5 %. В Российской Федерации аттестованная методика измерения массовой доли муки мягкой пшеницы основана на обнаружении глиадина методом иммуноферментного анализа. В то же время большинство зарубежных методов определения примеси мягкой пшеницы основаны на ПЦР. Наиболее перспективным считается метод цифровой ПЦР, обладающий лучшей чувствительностью и разрешающей способностью в ходе количественного анализа. Ранее нами была разработана система праймер-зонд для относительного определения мягкой пшеницы с помощью мультиплексной ПЦР в реальном времени. Большинство авторов анализировали готовую продукцию. Однако примесь мягкой пшеницы может возникать на различных этапах технологического процесса. Целью данной работы являлось обоснование применения метода цифровой ПЦР для расчёта доли ДНК мягкой пшеницы в макаронных изделиях, а также сырья, из которого они были выработаны. В результате исследование образцов модельной муки в сравнении с ПЦР в реальном времени показало воспроизводимость и достаточную чувствительность применения метода цифровой ПЦР. Анализ зерна, муки и готовой продукции, полученных от одного производителя, показал рост доли примеси в течение технологического процесса. Так, в образцах зерна ДНК мягкой пшеницы обнаружено не было. После помола примесь мягкой пшеницы обнаруживалась на уровне 0,5–1,1 %. В готовых макаронных изделиях примесь мягкой пшеницы составляла от 2,0 до 3,0 %. Таким образом, метод цифровой ПЦР может быть применён не только для контроля готовой продукции, но и для анализа технологической линии и выявления критических контрольных точек. Changes to GOST 31743-2017 limiting the admixture of common wheat in pasta to 5 % will come into force from August 1, 2024. In the Russian Federation, a certified method for measuring common wheat flour is based on the detection of gliadin by enzyme-linked immunosorbent assay. Most of foreign methods for determining the admixture of common wheat are based on PCR. The most promising method is considered to be digital PCR, which has better sensitivity and resolution during quantitative analysis. Previously, we developed a primer-probe system for the relative determination of common wheat by multiplex real-time PCR. Most of the studies was aimed at analyzing finished products. Contamination by common wheat flour can occur at various stages of а technological chain. The purpose of this work was to substantiate the application of digital PCR for relative estimation of common wheat DNA in pasta and raw materials. The study of samples of model flour in comparison with real-time PCR showed reproducibility and sufficient sensitivity of the application of digital PCR method. The analysis of grain, flour and finished products received from one manufacturer shows an increase the value of impurities during the technological process. Common wheat DNA was not found in grain samples. After grinding, the admixture of common wheat was found at the level of 0.5–1.1 %. In pasta the admixture of common wheat ranged from 2.0 to 3.0 %. Thus, digital PCR method can be applied not only to control finished products, but also to analyze a production chain and identify critical control points.