Étude de la physiopathologie de l’emphysème grâce à un modèle d’alvéolosphère en 3D à partir de cellules épithéliales alvéolaires de type 2 humaines

Abstract

Introduction

L’emphysème, une des composantes de la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), correspond à une destruction des alvéoles pulmonaires dont la physiopathologie est mal connue. Des modèles de culture de cellules épithéliales alvéolaires (AEC) en 3 dimensions (3D) dans du Matrigel permettent d’étudier les capacités de prolifération et de différenciation des AEC2, mais manquent de reproductibilité. L’objectif principal de ce travail est le développement pérenne d’un modèle d’alvéolosphères 3D à partir d’AEC2 humaines ainsi que la modélisation de l’emphysème par exposition à l’extrait de fumée de cigarettes (CSE).

Méthodes

Ce modèle est basé sur l’isolement d’AEC2 par tri immunomagnétique (HTII-280+) à partir de 18 échantillons de parenchymes issus de patients fumeurs et non-fumeurs. Ces cellules sont mises en culture 3D dans des micropuits d’hydrogel préformés (200 μm de diamètre) par photopolymérisation permettant une analyse morphologique (taille, lumière) et phénotypique (immunomarquages, qPCR, microscopie électronique [MET]) à j₁, 7, 14 et 21. L’impact de l’exposition à 5 jours de CSE 5 % est étudié par qPCR et immunomarquages sur les alvéolosphères. Enfin, les cytokines sécrétées par les sphères exposées au CSE sont analysées par cytokine array, secondairement confirmées par ELISA.

Résultats

Les alvéolosphères sont maintenues en culture pendant 21 jours et forment progressivement une lumière centrale, dès j₇. La présence d’une barrière épithéliale est confirmée par la mise en évidence de jonctions serrées et adhérentes par MET et immunomarquage ZO-1. Des qPCR à j₁, 7, 14 et 21 montrent une apparition progressive de marqueurs d’AEC1 (expression de p2xr4, pdpn) alors que les marqueurs d’AEC2 persistent (expression de abca3, sftpa, sftpc). Les organelles permettant la synthèse de surfactant sont visualisées en MET (corps lamellaires, corps lipidiques). Enfin, l’exposition à 5 jours de CSE 5 % entraine une tendance à une diminution de la viabilité cellulaire (calcéine), une augmentation des marqueurs de stress oxydant (expression de hmox, nqo1, srxn1 en qPCR) ainsi qu’un relargage des cytokines (MIF et IL8) dans le surnagent.

Conclusion

Ainsi, nous avons obtenu, à partir d’échantillons de patients fumeurs et non-fumeurs, un modèle reproductible d’alvéolosphères ayant une capacité d’auto organisation en 3D, répondant à la définition d’un d’organoïde et permettant l’étude de la physiopathologie de l’emphysème induite par l’exposition à l’extrait de fumée de cigarettes.