豌豆质膜内源CDPK对植物转脂蛋白CaMBP-10的磷酸化及CaMBP-10对激酶自磷酸化的影响

Abstract

植物转脂蛋白(LTPs)是多基因编码的蛋白家族, 广泛分布于高等植物. 虽然LTPs的确切功能至今仍不完全清楚, 但它参与植物生物、非生物胁迫反应以及它的抗性功能已成为近年来的研究热点. 关于LTPs功能的调节机制目前几乎一无所知. 最近, 从白菜中分离的钙调素结合蛋白-10(CaMBP-10)被鉴定为植物转脂蛋白家族成员, 并且, 体外实验证明钙调素(CaM)调节其脂质结合活性. 为了深入了解转脂蛋白功能的调节机制, 本文研究了CaMBP-10的磷酸化作用, 发现 CaMBP-10 可被豌豆质膜内源性蛋白激酶磷酸化, 钙离子(Ca2+)能刺激磷酸化, 钙螯合剂EGTA以及CaM拮抗剂W-7和TFP 均能显著抑制磷酸化. 免疫印迹分析最终确定该激酶为CDPK家族成员. 构建突变体进一步研究了CaMBP-10的磷酸化位点, 发现其位于蛋白的C-末端区域, 并与已确定的CaM结合位点重合. 同时, 分析结果表明CaM能抑制CaMBP-10的磷酸化. 反之, CaMBP-10的磷酸化又能阻断其与CaM的结合, 显示出两种调节方式相互竞争的特点. 为深入研究磷酸化作用对CaMBP-10脂质结合活性的影响, 构建突变体(Ser83Asp, Ser85Asp)以模拟磷酸化状态. 实验结果显示, 磷酸化作用能显著增强CaMBP-10的脂质结合活性, 而且突变体的脂质结合活性不受CaM的影响. 采用胶内磷酸化测定法(in-gel kinase assay)研究了激酶的自磷酸化特点以及CaMBP-10对激酶自磷酸化的影响, 发现CaMBP-10能激活激酶的自磷酸化, 激酶的自磷酸化又能促进其对底物的磷酸化作用. 这样, 激酶的自磷酸化与底物的磷酸化形成一种“正反馈环”的调节模式. 综合研究结果, 本文首次证明了LTP受CaM结合和CDPK磷酸化的双重调节. 而且, CaM结合位点与磷酸化位点的重合预示可能存在特殊的调节机制, 以协同应答胞内的Ca2+信号.