Tumorspezifische Gentherapie mit konditional replizierenden Adenoviren

Abstract

Fragestellung: Der Einsatz konditional replizierender Adenoviren (CRAds) ist ein neuer Ansatz der Krebsgentherapie zur selektiven Tumorzellzerstorung. Um die Tumorspezifitat der Adenoviren zu verbessern und Normalgewebe zu schonen, wird ein gewebe- bzw. tumorspezifischer Promotor in das Virusgenom kloniert. Der MDR1-Promotor (multiple drug resistance gene 1) erschien geeignet, da das korrespondierende Gen in Adriamycin (ADR) vorbehandelten Zellen induziert werden konnte. Somit handelt es sich um einen Chemotherapie induzierbaren Promotor. Um die Effizienz der viralen Infektion zu verbessern, wurde zusatzlich eine gentechnische Modifikation in das adenovirale Kapsid eingebracht. Dies erfolgte durch Ersatz der viralen Bindungsregion (Fiber-Knob vom Serotyp 5 durch eine Fiber-Knob Chimare vom Serotyp 3). Methoden: Der MDR1-Promotor wurde mittels Shuttle-Plasmiden in das adenovirale Plasmid pvkF5/3 kloniert. Auf diese Weise wurden zwei CRAds konstruiert (MDR-CRAds). Bei Ad5/3.MDR1E1 wurde der Wildtyppromotor durch den MDR1-Promotor ersetzt. Ad5/3.MDR1E1Δ24 besitzt zusatzlich eine 24 bp Mutation im E1 Gen und repliziert nur in Zellen mit einem Defekt in dem Retinoblastompathway, in ruhenden Zellen jedoch nicht. Dieser Mechanismus ist geeignet die Tumorspezifitat der Virusreplikation zusatzlich zu erhohen. Die onkolytische Potenz bzw. Toxizitat der Crads wurde in gynakologischen Zelllinien, nativen Tumorzellen und gesunden Kontrollzellen mittels Zytotoxizitatsassays und Immunhistologie getestet. Die MDR1-Expression in gynakologischen und primaren Zellen mit und ohne ADR-Behandlung wurde mittels Luziferase-Reportergenassays und quantitativer RT-PCR analysiert. Ebenso wurde die Infektiositat der 5/3 Fiberchimare vergleichend in Luziferase-Reportergenassays untersucht. Ergebnisse: In Zellen, die mit ADR behandelt wurden, zeigte sich eine verstarkte Aktivitat des MDR1-Promotors. In diesen Zellen replizierten die MDR-CRAds schneller als die Vergleichsviren, die den Wildtyppromotor besasen. Auserdem konnte in diesen Zellen trotz zytostatikainduzierter, verstarkter CAR-Expression eine bessere Infektion durch die 5/3-Fiberchimare nachgewiesen werden als nach Infektion mit Ad5. In normalen Kontrollzellen zeigte sich, verglichen mit den Vergleichsviren, eine langsamere Replikation der MDR-CRAds. In schwach proliferierenden Zellen replizierte Ad5/3.MDR1E1Δ24 langsamer als Ad5/3.MDR1E1. Schlussfolgerung: Die MDR-CRAds zeigten eine effektive Onkolyse in chemoresistenten Karzinomzellen und eine verlangsamte Replikation in Kontrollzellen. Beide sind geeignete Kandidaten fur eine kombinierte Chemo- und Gentherapie. Die Induzierbarkeit des Promotors in chemoresistenten Tumorzellen eroffnet die Moglichkeit neuer komplementarer Therapieansatze gynakologischer Tumoren.