Aggregation of 20 kDa Porcine Amelogenin in Solution: FTIR and AFM Analysis of the Accompanying Protein-conformational and Morphological Changes

Abstract

This study using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and atomic force microscopy (AFM) was undertaken to further elucidate the sequential alterations of amelogenin conformation and morphology in the process of protein aggregation. Porcine 148-residue amelogenin (called hereafter the 20 kDa amelogenin), which is the major matrix constituent in pig secretory enamel, was used as a model molecule. The results verified that the protein molecules in a monomeric state at 0°C have multiple conformational elements, whereas most of the structural elements become indiscernible in the progression of protein aggregation, except for the β-strand presumed to exist at the N-terminal region. The observations by AFM confirmed that the self-assembly process of the protein in aqueous milieu generates semispherical structures of around 20-30nm in diameter. The overall results support the theory that the programmed extracellular processing of amelogenins is directly mediated by the conserved primary structure and the resulting supramolecular aggregates. 抄録:本 研究 で は,フ ー リエ変換赤 外吸収 法(FTIR)と 原子 間力顕 微鏡(AFM)を 用 いて,ア メロゲ ニ ンが 溶 液 内で分 子間 会合体 を形 成 す る過程 に生 じる構 造 ・形 態変 化 を調 べた。 観察対 象 には,ブ タ基 質形成 期 エナ メ ル質 の主要 な基 質 タ ンパ クで あ る20kDaア メ ロゲ ニ ンを選ん だ。ア メロゲ ニ ンのFTIRス ペ ク トル 解析 か ら,溶 液 相 で単体 分子 として存在 しう る条件 下(0°C)で は二 次構造 を示 す ピー ク成分 が分離 され たが,溶 液温 度 の上昇 に伴 い,会 合体 が 形成 され る過程 で多 くの二 次構造 要素 は不明 瞭 とな った。 ただ し,N末 端 領域 に存在 す る と推 定 され る β-シー トは分離 して観察 され た。溶 液 内で形成 され た20kDaア メ ロゲ ニ ンの分子会 合体 は,そ のAFM 像 で は20-30nm径 の球 体 として特 徴 づ け られた。今 回の実験 結果 か ら}細 胞 外で のア メ ロゲニ ンの酵素切 断 に よ る低 分子化 現象 は,タ ンパ ク分 子 の一次構 造 の特質 に基 づ く分子 間会 合 によ る制御 を受 けてい る ことが示唆 さ