TECHNOLOGY FOR THE PRODUCTION OF GLYCOLIPIDS BY ENZYMATIC HYDROLYSIS USING PHOSPHOLIPASE C

Abstract

Особенности строения и доказанная биологическая активность растительных гликолипидов дела- ет их перспективным ингредиентом для использования в продуктах специализированного и функционального пи- тания. Основным недостатком существующих способов их получения является низкий выход конечного продукта, большая длительность процесса и использование токсичных растворителей. Разработанная нами стратегия выде- ления гликолипидов из системы полярные липиды–растительные лецитины, содержащих гликолипиды и фосфоли- пиды, предполагает одним из этапов изменение полярности фосфолипидов путем деструкции их молекул. Целью исследования являлось изучение процесса ферментативного гидролиза молекул фосфолипидов с использованием фосфолипазы С (PLC), которая расщепляет глицерофосфатную связь с образованием диацилглицеринов и фосфат- содержащих соединений, для изменения их полярности и обеспечения возможности последующего разделения си- стемы деструктурированные фосфолипиды–гликолипиды. Представлены результаты исследований ферментатив- ного гидролиза (биодеструкции) фосфолипидов в растительных лецитинах с использованием фосфолипазы С как одного из этапов получения растительных гликолипидов, содержащихся в высших растениях – галактолипиды, сульфолипиды и стерилгликозиды, в том числе их ацилированные формы. В качестве источника гликолипидов ис- пользовали обезжиренный подсолнечный лецитин (ОПЛ). Исследования компонентного состава ОПЛ проводили методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии по усовершенствованным ме- тодикам. В составе ОПЛ идентифицированы следующие основные группы фосфолипидов, %: фосфатидилэтано- ламины (PE) – 10,92, фосфатидилхолины (PC) – 22,74, фосфатидные кислоты (PA) – 3,02, лизофосфатидилхолины (LPC) – 0,36, фосфатидилинозитолы (PI) – 13,03. Выявлено, что гликолипиды ОПЛ в основном представлены следу- ющими группами, %: дигалактозилдиацилглицеролы (DGDG) – 2,25, стерилгликозиды (SG) – 8,99 и этерифициро- ванные стерилгликозиды (ESG) – 2,67. В составе ОПЛ идентифицированы группы углеводов, которые представлены сахарозой (3,10%), стахиозой (2,34%) и раффинозой (1,91%). Экспериментально определена интегральная степень гидролиза фосфолипидов с использованием фосфолипазы С, которая составила около 87,5%, а также степень ги- дролиза для индивидуальных групп. Исследованы процессы распределения продуктов гидролиза между фракциями после фракционирования гидролизата экстракцией ацетона (ацетоннерастворимая и ацетонрастворимая фракции). Установлено, что в результате ферментативного гидролиза фосфолипидов, входящих в состав ОПЛ, с использованием фосфолипазы С и последующего фракционирования системы ацетоном большая часть (83,2%) гликолипидов была сконцентрирована в ацетоннерастворимой фракции. Ацетонрастворимая фракция представлена преимущественно диглицеридами (85,24%), а также частично недеструктурированными фосфолипидами, гликолипидами и углеводами. The structural features and proven biological activity of plant glycolipids make them a promising ingredient for use in specialized and functional food products. The main disadvantage of existing methods for their production is the low yield of the final product, the long duration of the process and the use of toxic solvents. The strategy we have developed for isolating glycolipids from the polar lipids–plant lecithins system containing glycolipids and phospholipids involves one of the stages changing the polarity of phospholipids through the destruction of their molecules. The purpose of the study was to study the process of enzymatic hydrolysis of phospholipid molecules using phospholipase C (PLC), which cleaves the glycerophosphate bond to form diacylglycerols and phosphate-containing compounds, to change their polarity and enable the subsequent separation of the destructured phospholipids–glycolipids system. The results of studies of enzymatic hydrolysis (biodegradation) of phospholipids in plant lecithins using phospholipase C as one of the stages in the production of plant glycolipids contained in higher plants – galactolipids, sulfolipids and steryl glycosides, including their acylated forms – are presented. Defatted sunflower lecithin (DSL) was used as a source of glycolipids. Studies of the component composition of OPL were carried out using high-performance liquid chromatography and gas chromatography using improved methods. The following main groups of phospholipids were identified in OPL, %: phosphatidylethanolamines (PE) – 10,92, phosphatidylcholines (PC) – 22,74, phosphatidic acids (PA) – 3,02, lysophosphatidylcholines (LPC) – 0,36, phosphatidylinositols (PI) – 13,03. It was revealed that OPL glycolipids are mainly represented by the following groups, %: digalactosyldiacylglycerols (DGDG) – 2,25, steryl glycosides (SG) – 8,99 and esterified steryl glycosides (ESG) – 2,67. Groups of carbohydrates have been identified as part of OPL, which are represented by sucrose (3,10%), stachyose (2,34%) and raffinose (1,91%). The integral degree of hydrolysis of phospholipids using phospholipase C was experimentally determined, which was about 87,5%, as well as the degree of hydrolysis for individual groups. The processes of distribution of hydrolysis products between fractions after fractionation of the hydrolyzate by extraction of acetone (acetone-insoluble and acetone-soluble fractions) were studied. It was found that as a result of enzymatic hydrolysis of phospholipids included in OPL using phospholipase C and subsequent fractionation of the system with acetone, the majority (83,2%) of glycolipids was concentrated in the acetone-insoluble fraction. The acetone-soluble fraction is represented mainly by diglycerides (85,24%), as well as partially unstructured phospholipids, glycolipids and carbohydrates.