Клонирование и экспрессия гена целлюлазы Penicillium sp. ‘occitanis’ в Komagataella phaffii T07, выделение и анализ свойств

Abstract

Проведены клонирование и анализ свойств целлюлазы Penicillium sp. ‘occitanis’. Ген был обнаружен в геномных данных базы NCBI. Получена плазмида pPZL-4xBGLU-Pocc, несущая четыре копии конструкции, экспрессирующей ген целлюлазы P. sp. ‘occitanis’. Плазмида была клонирована в штамм дрожжей Komagataella phaffii T07 под контроль промотора и терминатора гена AOX1. Было клонировано четыре копии экспрессирующей конструкции. В результате получен штамм K. phaffii T07 BGLU-4xPocc. Максимальный уровень экспрессии этого штамма составил ~4 000 000 Ед/л культуральной жидкости при культивировании в 5-литровом биореакторе. Полученный белок, согласно данным гельэлектрофореза, дает полосу ~39.5 кДа, что соответствует расчетной массе, и обширную область примерно от 42 до 70 кДa. Формирование этой области говорит о возможном гликозилировании белка при экспрессии в K. phaffii. Анализ свойств фермента показал, что температурный оптимум активности составляет 55–65 °С, рН оптимум – примерно 1.5–2. Фермент сохраняет 50 % активности при pH от 1.5 до 6 и от 30 до 80 °С. Он стабилен при температуре ниже 75 °С в течение 4 ч, но при 85 °С за 4 ч теряет 50 % активности. Фермент устойчив при рН от 4 до 7.5.