Carbon Dioxide Laser Irradiation Stimulates Mineralization in Dental Pulp Cells

Abstract

Reparative dentin is formed in the dental pulp in response to various external stimuli such as caries and abrasion. Carbon dioxide laser has been used to accelerate the formation of reparative dentin on the exposed pulp surface. However, the mechanism by which carbon dioxide laser irradiation stimulates mineralization in direct pulp capping treatment is not fully understood. We examined the effects of carbon dioxide laser irradiation on mineralization in rat dental pulp cells. Rat dental pulp cells were irradiated with a carbon dioxide laser at an output power of 2 W for 20, 40, and 60 s and were cultured in media containing ascorbic acid and β-glycerophosphate. Cell viability was examined 24 h after laser irradiation by a modified MTT assay. Alizarin Red S staining was performed 10 days after laser irradiation. The amounts of collagen secreted from the cells after irradiation were quantified following Sirius Red staining. The expression levels of collagen type I and HSP47, collagen-binding stress protein, were analyzed by real-time PCR. HSP47 protein expression was examined by Western blotting. The cell viability was not affected by laser irradiation at 2 W for up to 40 s. However, it was significantly decreased by 20% at 60 s. The amount of mineralization after 10 days of irradiation at 2 W for 40 s was significantly increased in comparison to the other conditions. The extracellular collagen production was significantly increased, by 73% on day 2 and 38% on day 4, after laser irradiation. Although collagen type I gene expression was not changed by laser irradiation, HSP47 gene and protein expression was induced within 12 h and 24 h, respectively. These results suggested that carbon dioxide laser irradiation stimulated mineralization in dental pulp cells by increasing HSP47 expression. (J. Jpn. Soc. Laser Dent. 21:197 ~ 202, 2010 Reprint requests to Dr. YASUDA) Key words= Carbon dioxide laser, Dental pulp cells, Odontoblasts, Mineralization キーワード=炭酸ガスレーザー,歯髄細胞,象牙芽細胞,石灰化 〒 061-0293 北海道石狩郡当別町金沢 1757 TEL 0133-23-1726 FAX 0133-23-1726 1757 Tobetsu, Hokkaido 061-0293, Japan. TEL +81-133-23-1726 FAX +81-133-23-1726 198 日本レーザー歯学会誌 21:197-202,2010 牙質で覆い,かつ歯髄の炎症反応が認められないことが理 想とされる。 現在,レーザーが切開,止血,根管内殺菌や歯石除去な どその適応の広さから歯科臨床において広く利用されてい る。その中でも半導体レーザーなどの低出力レーザーには 創傷治癒の促進効果があり9),抜歯創や非感染性の露髄面 への応用により硬組織形成促進効果が観察されている。ま た,培養細胞レベルにおいても半導体レーザー照射により 細胞分化促進や石灰化結節の増大などが認められてい る10-12)。一方で,炭酸ガスレーザーなどの高出力レーザー は主に組織の蒸散により切開や病巣部の除去などを目的と してきた13)。現在では低出力照射により石灰化誘導やイ ンプラント周囲骨の再生への応用が期待されている14,15)。 HSP(heat shock protein)は,熱や薬剤刺激などのス トレスによって発現が誘導され,変性タンパク質の凝集抑 制を行うタンパク質として知られている16,17)。また,正常 な細胞でも構成的に発現しており,新生タンパク質の フォールディングや細胞内輸送などの重要な機能に関わっ ていることも明らかになってきた18,19)。その中でも HSP47 はコラーゲン特異的分子シャペロンで,コラーゲ ンに特異的に結合し,その合成過程におけるフォールディ ングを正しく導くことでコラーゲン産生に必須な役割を持 つことが知られている20,21)。 これまでに,直接覆髄実験において露髄面への炭酸ガス レーザー照射の有用性が示唆されている22)が,培養歯髄 細胞を用いた細胞レベルでの石灰化への影響についての報 告はほとんどない。そこで今回,炭酸ガスレーザー低出力 照射の象牙芽細胞の石灰化誘導効果について今までに明ら かとしてきたデータを提示23)し考察する。 炭酸ガスレーザー照射の細胞生存率への影響 ラット歯髄細胞に対して 2 W 出力で 20,40 および 60 秒間炭酸ガスレーザー照射し,24 時間後の細胞生存率を 測定した。24 穴プレートにラット歯髄細胞を 2×10 個播 種し,24 時間後無血清培地に交換しさらに 24 時間培養し た後,培地を除いて細胞に 2 W の出力,A4 モード,照射 距離 2 cm,30 秒間走査法にて炭酸ガスレーザー照射を 行った(図 1)。炭酸ガスレーザーは Bel Luxar LX-20SP (タカラ,東京)を,チップはセラミックチップを使用し た。照射スポットサイズは約 2 mm で,エネルギー密度は 2 W,40 秒照射で 382.2W/cm2 となる。20 および 40 秒間 照射を受けた細胞はコントロールとの間で生存率に差は見 られなかったが,60 秒間照射を受けた細胞の生存率は約 80%でコントロールに比べて有意に減少した(図 2a)。 炭酸ガスレーザーは,軟組織の切開や止血などの効果を 持つ光熱作用と,疼痛緩和なの効果を発揮する光化学作用 を有しており,現在臨床で幅広い症例に対して使用されて いる13)。Moritz らは,直接覆髄実験において水酸化カル シウム製剤の貼布前に露髄面への炭酸ガスレーザー照射の 効果を調べた22)。2 年後でも 93%の歯髄が生活反応を示 したのに対して,未照射では 66%であったと報告してい る。つまり,炭酸ガスレーザーは修復象牙質形成を促進 し,直接覆髄治療においても有用であることを示唆してい る。今回用いた実験系では,炭酸ガスレーザーの 2 W,60 秒間の照射条件では,細胞生存率の低下が認められたこと から,低出力照射でも照射時間が長くなるとエネルギー密 度が増大し,細胞に対して傷害を与えることが明らかと なった。 図 1 (写真左)実験に使用した炭酸ガスレーザー(Bel Luxar LX-20SP,タカラ),(写真右) 照射距離 2 cm,出力 2 W で走査法にてラット歯髄細胞に照射を行った。 199 2010 年 12 月 安田善之・他 炭酸ガスレーザー照射による象牙芽細胞の石灰化誘導