PADRONIZAÇÃO DE METODOLOGIA CRISPR/DCAS9 PARA IDENTIFICAÇÃO DE INTEGRAÇÃO DE MINICÍRCULOS DE KDNA DE TRYPANOSOMA CRUZI NO GENOMA DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS

Abstract

Introdução: A doença de Chagas (DC) é uma doença infecciosa causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas estejam infectadas no mundo todo. Destes, aproximadamente 30% evoluem para a fase crônica sintomática, caracterizada pelo desenvolvimento de manifestações cardíacas, digestivas ou mistas. A integração de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma hospedeiro é um dos fatores que pode influenciar na evolução da patogênese da DC. Diversos experimentos demonstraram a transferência de kDNA do parasito para os genomas de diferentes vertebrados. Na maioria dos casos, os minicírculos de kDNA estavam associados a retrotransposons do tipo LINE-1, permitindo a mobilização do kDNA para diferentes locais do genoma. Tais inserções poderiam resultar no surgimento de novas proteínas, na alteração da expressão ou, até mesmo, no silenciamento de genes. O sistema CRISPR/dCas9 representa uma plataforma promissora para complementar os estudos acerca da transferência gênica lateral. Esse sistema adaptado possibilita a geração de imagens de sequências específicas de DNA endógeno de células vivas, permitindo a visualização da organização e dinâmica de integração de kDNA nas células. Objetivos: Quantificar a população de células que contém as integrações no genoma ao longo de diferentes períodos de tempo e determinar se a presença do parasito é necessária para a propagação das integrações. Metodologia: Células HEK-293 serão infectadas com a cepa Y de T. cruzi e divididas em dois grupos, onde um deles receberá tratamento com Benznidazol. Os grupos serão transfectados com o sistema CRISPR/dCas9 utilizando RNAs guias voltados para sequências de minicírculos de kDNA, para regiões de LINE-1 e para uma sequência não direcionada ao genoma humano, que servirá como controle negativo. As transfecções serão analisadas por microscópio de fluorescência. Resultados: Até o momento, os resultados da transfecção com sgRNA de LINE-1 mostraram o bom funcionamento do sistema CRISPR/dCas9, bem como sua capacidade em reconhecer sequências repetitivas no genoma. Conclusão: Os resultados preliminares mostram que é possível rastrear o número de cópias de determinada sequência dentro da célula. Assim, a integração de kDNA de T. cruzi poderia ser monitorada durante toda a infecção, permitindo analisar a interação parasito-hospedeiro a nível celular.