Construction of human angiopoietin-1 fukaryotic expression vecter and its expression in human umbilical mesenchymal stem cells

Chinese Ophthalmic Research Pub Date : 2010-09-10 DOI:10.3969/J.ISSN.1003-0808.2010.09.014

萧鸿, 刘帅, 李群秀, 张克剑, 侯阳, 宋慧娟, 刘学政

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Abstract

目的构建人血管生成素-1(Ang-1)基因的真核表达载体,并检测其在人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)中的表达,为进一步研究Ang-1防治糖尿病视网膜病变(DR)的血管渗漏提供实验依据.方法提取人胎盘组织中的总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)特异性扩增Ang-1编码区序列,亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1.将pEGFP-N1-Ang-1导入UC-MSCs,然后应用含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基对人UC-MSCs进行培养,荧光显微镜下观察Ang-1在人UC-MSCs中的表达,Western blot法检测重组体的表达.结果 RT-PCR法成功克隆人Ang-1基因编码区序列,纯度为1.82;PCR扩增的片段长度为1.5 kb,与预期片段大小相近.双酶切鉴定法可识别重组pEGFP-N1-Ang-1转染质粒,目的基因与预期基因序列的同源性为100%.人UC-MSCs转染的pEGFP-N1/Ang-1质粒能够表达Ang-1蛋白,呈现绿色荧光.转染pEGFP-N1的人UC-MSCs和对照组人UC-MSCs均未见相应的Ang-1蛋白表达.结论成功地克隆出人的Ang-1基因并构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ang-1,为将Ang-1基因转染至人UC-MSCs治疗DR奠定了基础。

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人血管生成素-1核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

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