130多年前，德国生物学家阿尔布雷希特·科塞尔首次从茶叶中提取茶碱。茶碱已被用作支气管扩张剂来治疗气道疾病，包括慢性阻塞性肺病、哮喘和婴儿呼吸暂停，因为它能放松支气管肌肉，降低气道反应性，并具有抗炎特性。然而，其狭窄的治疗指标需要仔细监测浓度，因为浓度升高可能导致恶心和心律失常等副作用。茶碱特异性适配体是一种短单链DNA或RNA序列，可以高特异性地靶向茶碱，从而发挥生物传感器的作用。适体具有合成简单、成本效益高、免疫原性低等优点，在生物传感、环境监测和临床应用中得到了越来越多的应用。尽管结构生物学已经阐明了茶碱RNA适体对茶碱的显著特异性，但DNA适体对咖啡因的选择性仍不清楚。

大多数适体是通过指数富集（SELEX）实验从配体的系统进化中获得的。然而，SELEX的缺点，如实验周期长、操作程序复杂和特异性挑战，阻碍了成本效益和效率，极大地限制了其在大规模选择工作中的应用。近年来，多个研究小组成功地利用现有的天然核开关或核酶作为支架来选择新的适体，这些适体在体内折叠良好，功能有效。然而，这些方法还没有消除传统SELEX程序中固有的某些常规方面。

在这项研究中，作者通过检测茶碱DNA适配体与茶碱、3-甲基黄嘌呤、次黄嘌呤（TEP、3-M和HPA）相互作用的晶体结构，描绘了茶碱DNA适配体的配体结合机制。许多天然适配体（核糖开关）具有相似的二级和三级结构，但仅仅改变结合袋内的关键核苷酸就可以导致识别不同的小分子。作者遵循“顺其自然”的原则，通过突变茶碱结合口袋中的核苷酸，计算模拟了腺嘌呤适配体和preQ1适配体。其晶体结构证实，腺嘌呤适配体保留了亲代支架，同时形成了一个独特的腺嘌呤结合袋。生化实验进一步验证了其配体识别机制和特异性。虽然preQ1适配体缺乏晶体结构，但等温滴定量热（ITC）实验证明了它的特异性。本研究将结构生物学和计算生物学结合起来，设计了一种简单而有效的新适体合成技术。

最近，中山大学孙逸仙纪念医院黄林教授团队通过解析DNA茶碱适配体与不同配体（TEP、3-M和HPA）的晶体结构，揭示了其配体结合机制。基于结构信息，作者对关键核苷酸（A17和T22）进行理性突变，成功设计出选择性结合腺嘌呤和preQ1的新型DNA适配体，并通过生化实验（ITC、EMSA）和晶体学验证其特异性。该研究为基于结构的适配体设计提供了新策略。这一成果以“From Theophylline to Adenine or preQ1: Repurposing a DNA Aptamer Revealed by Crystal Structure Analysis”发表在《Angewandte Chemie International Edition》上。

 图 1. 茶碱DNA适配体的整体结构。a：茶碱（TEP）、3-甲基黄嘌呤（3-M）、次黄嘌呤（HPA）的化学结构。b：茶碱DNA适配体的预测二级结构（茎环结构）。c-d：晶体结构中的二级结构示意图（卡通模式）和整体表面结构，显示配体结合口袋的闭合性。e：表面视图展示单一半封闭配体结合口袋。关键点：适配体由P1和P2茎区及中间的配体结合区组成，T10核苷酸形成“盖子”稳定结合口袋。

 图 2. 配体结合机制的三重碱基相互作用a：配体结合区域的卡通模式示意图，包含三个三重碱基相互作用平面。b-d： 三重碱基相互作用细节（G19:G6:C24、G18:G7:C23、T8:C9:G21）。e-g：茶碱（TEP）、3-M、HPA分别与A17和T22的氢键相互作用（O6、N7等关键位点）。关键点：茶碱通过A17和T22形成氢键网络，而咖啡因因N7甲基化无法结合。

图 3. 生化实验验证配体结合。a：电泳迁移率转移试验（EMSA）实验显示适配体与茶碱和3-M结合后迁移率变化，而HPA和Xanthine无结合。b-d：等温滴定量热法（ITC）实验测定野生型与突变体（A17G、T22C等）的结合亲和力（TEP Kd = 0.92 μM，3-M Kd = 7.7 μM，HPA无结合）。关键点：突变体（如A17G/T22C）完全失去结合能力，验证A17和T22的关键作用。

 图 4. 计算设计与新型适配体验证。a：通过A17和T22位点突变设计新适配体的策略。b：分子对接预测突变体（如DNA-T-T和DNA-C-T）对腺嘌呤和preQ1的结合优势。c-f：ITC验证DNA-C-T结合preQ1（Kd=1.3 μM）和DNA-T-T结合腺嘌呤（Kd=57 μM），且无交叉反应。关键点：DNA-C-T为首个DNA preQ1适配体，DNA-T-T特异性结合腺嘌呤（不响应AMP/ADP/ATP）。

图 5. 腺嘌呤适配体的晶体结构验证。a-b：DNA-T-T+2适配体的二级结构和整体晶体结构（PDB: 8ZAS），显示二聚体对称结合位点。c-e：腺嘌呤与突变核苷酸T17和T22的氢键相互作用（N1、N3、N6等位点）。关键点：突变适配体保留母体骨架（RMSD=1.202），氢键模式与计算预测一致。

作者研究提出了一种合理设计具有改变配体特异性的DNA适体的策略。通过分析茶碱特异性DNA适配体与不同配体的晶体结构，作者确定了结合所必需的关键核苷酸。利用计算模拟，作者将突变引入这些位点，成功地开发了新的preQ1和腺嘌呤结合适配体。这项工作证明了结构引导工程的潜力，可以快速跟踪为诊断或治疗目的定制适配体的生产。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202504107

黄林

中山大学孙逸仙纪念医院PI、分子医学专业博士生导师，2019年入选中山大学“百人计划”-中青年杰出人才，2022年入选广东省“珠江人才计划”-青年拔尖人才项目，2023年入选国家高层次青年人才项目。核酸结构研究组 Nucleic Acid Structure Research Group依托科技部长链非编码RNA与重大疾病国际科技合作基地、RNA医学学科创新引智基地以及粤港RNA医学联合实验室，主要围绕“非编码RNA序列、结构与功能的关系”这一重要科学问题开展研究，立足于系统理解多个RNA motif，并深入理解含有这些RNA motif的ncRNA的功能（包括核糖开关、核酶、微生物ncRNA、长非编码RNA、环形RNA等）。

主要研究方向

1. 非编码RNA的结构与功能（核糖开关、核酶、致病微生物中未知功能非编码RNA）

2. 非编码RNA在特定疾病的发生和发展过程中的作用及分子机制

3. 生物信息RNA结构预测

编辑：朱亮

审核：王娇娇

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